文献速递高通量筛选生物组织中种
摘要
快速有效地测定组织样本中痕量污染物已成为全球需求。涂层叶片喷雾(CBS)萃取/电离技术，能够通过单个设备实现复杂基质中分析物的富集，以及通过电喷雾电离直接接口将目标分析物引入质谱中。为了快速筛选样品组织，本研究首次将聚丙烯腈（PAN）作为CBS设备底漆，使金属表面具有生物相容性，该附加组件旨在保护刀片表面的不锈钢部分，避免不锈钢暴露于基质中，减少基质大分子、细胞和脂肪的粘附。此外，本研究还首次介绍了CBS在负电离模式下的定量应用。优化的CBS工作流程允许在一次运行中以负和正两种电离模式对均质牛肉组织中的种兽药进行快速高通量筛选和定量。使用单个CBS设备，对96个样本同时进行提取时，每个样本的分析时间最短为1分钟。每个电离模式中分别用一个内标进行校正，获得了良好的准确度和精密度，90%以上的分析物落回收率在70%~%，RSD为25%。大多数分析物的线性相关系数0.99，种分析物均满足加拿大和美国的监管水平。背景为了能在短时间内对大量目标物进行快速筛选和定量，质谱串联技术是目前最有效的方法之一。但由于样品基质影响，对检出结果有较大的干扰。因此，本文中选用CBS进行样品前处理。
目前，CBS已广泛应用于血液、尿液等生物液体的快速定性及定量的检测中。但均质样品中存在大分子、细胞碎片等多种基质，富集于CBS的难度较大。因此，本文将具有良好生物相容性的PAN涂于CBS表面，保证不锈钢在提取过程中不与样品接触，消除基质大分子黏于不锈钢表面。同时，PAN作为粘合剂，可更好的使萃取颗粒（HLB）固定于叶片表面。
实验思路一.前处理部分1.CBS设备制备将厚度为5μm，长度为20mm的PAN涂于不锈钢表面，再将长度为10mm的HLB涂于PAN表面，以此组成CBS设备，如图1A所示。提取过程中CBS设备的使用如图1B所示。图12.选择目标兽药本研究选取了种兽药，在液相色谱-电喷雾电离-串联质谱技术中进行检测，在正离子模式下成功定量了种兽药。
3.样品处理低温下磨碎样品，称取2g于离心管中，加入μL加标溶液和60μL内标溶液（1ng/μL）,涡旋1min，机械搅拌1h，于4℃冰箱下保存过夜，使样品充分混合。取出冰箱后，机械搅拌1h，使样品达到室温。加入6mL去离子水，涡旋1min，移至96孔板。
4.CBS萃取（图2A所示）用甲醇：水（50：50v/v）溶液冲洗CBS设备，将CBS设备移入制备好的样品中，最后用丙酮：水（15：85v/v）溶液洗去杂质。用12μL含5mM氯化铵的甲醇：乙腈：水（80：15：5）溶液对目标物进行解析，10s后至于原位电离质谱
口。在电压作用下（如图2B），叶片尖端发生电离，分析物直接进入质谱中。图2二.检测部分1.基质效应本文先考察了该样品的基质效应。公式如下：
基质效应=（基质标准曲线-试剂标准曲线）*%/试剂标准曲线本文通过配置基质标准曲线对分析物进行定量。2.该方法对分析物母体分子质量的影响。（如图3）大部分分析物受到信号抑制，其中69%的分析物信号抑制或增强小于60%。在没有色谱分离的条件下，这一效果已较为理想。此外，研究中显示，缩短提取时间，可最大化的减少对不必要杂质的共提取，提高结果准确性。同时，基质标准曲线与内标相结合，可达到基质效应最小化，但庞大的分析物数量使内标法不适用于本研究。
图33.该方法对离子比的影响（图4）离子比相对偏差=（平均基质离子比-参考离子比）*%/参考离子比
图中，大部分分析物（71%）的离子比相对偏差在参考值的±10%之内，只有9%的分析物的离子比相对偏差参考值的±50%以外。图44.该方法下，不同浓度的分析物的参考离子比例对应的离子比偏差（图5）选取了含不同浓度分析物的样品（0.75X，1X，1.5X；X为兽药最大限量值)。由图，离子比偏差与浓度基本无关。
图55.基于内标条件下，对基质标准曲线的线性拟合度的研究（图6）每个分析物在0.25X~2.5X中选取7个浓度，建立标曲。其中，55%分析物的R2高于0.99；45%分析物的R2在0.95~0.99之间。同时，通过基质标准曲线和线性回归计算，得到了兽药的最低检测限（LOQ）以确保实验中研究的兽药浓度达到最低浓度。
图66.实际样品的回收率（图7）本文中验证了对实际样品中分析物定量的准确性和精密性。在基质空白的样品中，加入低、中、高（0.4X、0.75X、1.5X）三个浓度的分析物。根据基质标准曲线和线性回归计算的估计浓度值算精确度，相对标准偏差（RSD）为25%。
图7总结本研究中，大部分分析物在线性、准确性、重复性等方面有优异的结果，但仍有少数分析物结果不理想。这可能是由于内标物选取不当；不佳的化学涂层；不合适的解析溶剂等原因造成的。这项工作的不是萃取方法优化或验证，而是设计、评估和报告直接从均质组织样本中提取目标物，通过单一的正离子或负离子模式进行高通量检测。
研究表明，优化的CBS技术对快速筛选和定量复杂基质中的多种分析物有较好的效果，并在同一种离子模式下进行高通将检测是可以实现的。但是，原位电离质谱缺少色谱法来分离物质，对同分异构体和同压分析物难以区分。因此，使用基质标准曲线和内标法可达到最佳的检测效果。
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